Terreni di coltura cellulare: Il siero fetale bovino…Può e deve essere sostituito dalle Alternative “serum-free”.

Il siero fetale bovino e le Alternative sostitutive nei terreni di coltura “serum-free” (non animali).

I metodi in vitro si possono utilizzare per studiare le attività metaboliche delle cellule. Inoltre, nell’ottica delle 3R (Refinement, Reduction, Replacement) essi possono rappresentare strumenti potenti per ridurre o anche sostituire gli esperimenti su animali, sia come ”stand-alone”, sia come parte di una strategia di sperimentazione insieme ad altri metodi non basati sull’animale. Le cellule sono mantenute in condizioni definite e consolidate nel tempo, che in genere coinvolgono l’incubazione a 37° C, con una miscela di gas umidificata al 5% di CO2. Un terreno di base spesso utilizzato è il Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM). A seconda del tipo di cellula questo mezzo è completato con elementi essenziali per la proliferazione, la migrazione e la differenziazione delle cellule. Solitamente, il siero usato come integratore è quello bovino fetale (l’FBS, Fetal Bovine Serum, o l’FCS, Fetal Calf Serum) [1]. I sieri più utilizzati sono quelli ottenuti da animali neonati oppure dai feti bovini.

Il siero animale è una miscela estremamente complessa di un gran numero di costituenti, biomolecole a basso ed alto peso molecolare, con diverse attività, fisiologicamente bilanciati che favoriscono crescita ed inibitori enzimatici.

La moderna biologia cellulare e la biochimica hanno permesso l’identificazione dei fattori di crescita del siero coinvolti nei processi ”in vivo”, come la proliferazione cellulare e la riparazione dei tessuti, ad es. la guarigione delle ferite [2], la maturazione e differenziazione cellulare, oppure la maturazione embrionale, il lignaggio delle cellule staminali, la differenziazione epiteliale, etc.

Le principali funzioni del siero sono di fornire:

1. fattori ormonali per stimolare la crescita e la proliferazione cellulare e la promozione di funzioni differenziate

2. proteine ​​di trasporto che trasportano ormoni (ad es. transcortina), minerali ed oligoelementi (ad es. transferrina) e lipidi (ad es. lipoproteine​​)

3. fattori di attaccamento e diffusione, in qualità di punti di germinazione per fattori di attaccamento cellulare

4. stabilizzanti e disintossicanti necessari per mantenere il pH o inibire le proteasi sia direttamente, come ad esempio con l’aggiunta di α-antitripsina o α2-macroglobulina, o indirettamente, agendo come un diluitore non specifico per le proteasi ed altre molecole (tossiche) [3].

1979

Tuttavia, l’utilizzo di siero animale comporta diversi e rilevanti problemi sia di tipo scientifico che etico.

– Preoccupazioni etiche e questioni relative al benessere degli animali

La quantità di FBS prodotta per il mercato mondiale è stimata aggirarsi sui 500.000 litri all’anno. Di conseguenza, più di 1 milione di feti bovini vengono sottoposti al prelievo del loro siero, e questi numeri sono stimati in aumento di anno in anno [4-5].

Recentemente, gravi preoccupazioni etiche sono state sollevate per quanto riguarda il benessere dei feti donatori nella raccolta, la produzione e la lavorazione dell’FBS [6-7-8-9-10]. Le preoccupazioni si sono concentrate principalmente sulle attuali modalità di raccolta dell’FBS che possono causare sofferenza agli animali utilizzati, in particolare i feti.

In breve, i feti bovini da cui il sangue viene prelevato per la produzione dell’FBS sono ottenuti da vacche gravide inviate al macello. Nelle enormi mandrie di bovini ”da carne”, tori e mucche vagano liberamente insieme, e di conseguenza molte mucche vengono trovate gravide al momento della macellazione. Quando all’atto della macellazione una mucca viene scoperta incinta, il feto viene separato ed il sangue fetale dovrebbe essere raccolto in condizioni asettiche. Tuttavia, nonostante le norme vigenti sul benessere degli animali, la situazione specifica presso i siti di produzione locale non può garantire sempre le migliori prassi nel trattamento dei feti durante la raccolta del sangue e le condizioni del sangue stesso.

1977

Questo prelievo viene di solito eseguito utilizzando grossi aghi infilati direttamente nel cuore pulsante del feto senza ricorrere ad anestesia, definito scientificamente “pungolamento cardiaco” [3].

1978

In alternativa, il sangue fetale può essere raccolto mediante puntura della vena ombelicale o puntura della vena giugulare [5]. Pertanto la raccolta del sangue fetale comporta la manipolazione significativa del feto.

–  Preoccupazioni scientifiche

Dal punto di vista biologico cellulare, gli svantaggi della supplementazione dei terreni di coltura con l’FBS sono molteplici:

1. il siero è un integratore mal definito, e quindi rappresenta un fattore non prevedibile nella coltura cellulare e poco ripetibile (ogni batch di siero è diverso, come è diverso ogni animale da cui proviene il siero) [11-12]

2. i lotti di siero mostrano variazioni quantitative e qualitative nella loro composizione e quindi introducono una variabilità grave da lotto a lotto rendendo gli esperimenti (e quindi i risultati) non scientificamente riproducibili [13]

3. il  siero può contenere diverse quantità di endotossine, emoglobina, ed altri fattori variabili e negativi per la corretta riuscita di un esperimento, perchè derivanti dalle condizioni soggettive dell’animale al momento del prelievo, dall’ambiente, dalla salute  e dallo stress di ogni singolo animale

4. il siero può essere anche una potenziale fonte di contaminanti quali batteri, funghi, micoplasmi, virus o prioni [14-15-16]

Quindi, il siero presenta diverse variabili sconosciute nel sistema di coltura [17-18-19] rendendo gli esperimenti poco attendibili perché non riproducibili esattamente con le stesse condizioni.

Inoltre, i terreni di coltura siero-integrati possono essere incapaci di sostenere la crescita di specifici tipi di cellule, e nelle colture primarie di cellule epiteliali altamente differenziate, il siero animale può essere incapace di prevenire la crescita eccessiva della coltura da fibroblasti [20]. Nondimeno, per ovviare a questo genere di inconvenienti relativi all’uso dell’FBS, sono stati sviluppati terreni di coltura cellulare di derivazione NON-animale capaci di ridurre fortemente o anche sostituire completamente il siero fetale bovino [21-22], come ad esempio il lisato piastrinico umano [23-24], oppure, i sieri artificiali, che ora molte compagnie stanno sviluppando per ovviare alle differenze tra batch ed alla contaminazione. .

1982PowerCHO and X-VIVO Serum-free media

I benefici (scientifici ed etici) della sostituzione del siero animale sono molti, tra cui aspetti biologici e specifici per le colture cellulari:

– Condizioni di coltura in vitro chimicamente definite e controllate

– Ridotta variabilità nella composizione dei terreni di coltura

– Riduzione dei rischi di contaminazione (micoplasma, virus, prioni)

– Vantaggi nell’isolamento dei prodotti di coltura cellulare (down-stream processing)

– Standardizzazione dei protocolli a causa della natura quantificabile e riproducibile dei terreni di coltura non animali, indipendenti dai problemi di batch riscontrati con l’uso di siero animale

Aspetti etici:

– Si evita del tutto la sofferenza degli animali

Alla luce di queste importanti innovazioni tecnologiche, diventa sempre più insistente la sollecitazione di molti scienziati, rivolta  agli organi regolatori, onde sostituire il siero animale con metodi più moderni, affidabili e certamente più etici [25-26].

08 agosto 2014

A.L. – C.N.

1992

1993

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Referenze:

[1] van der Valk J. et al. Improving in vitro methods by developing and using defined culture media. Altex 27, Suppl. 2/10:140-141, 2010 – http://www.altex.ch/resources/van_der_Valk.pdf

[2] Werner S, Grose, R. (2003). Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol. Rev. 83, 835-870 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12843410

[3] Brunner D. et al. Serum-free Cell Culture: The Serum-free Media Interactive Online Database. ALTEX. 2010;27(1):53-62 – http://www.altex.ch/resources/Altex_1_10_Brunner.PDF

[4] Shah G. (1999). Why do we still use serum in the production of biopharmaceuticals? Dev. Biol. Stand. 99, 17-22 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10404871

[5] Jochems C. E. A. et al. (2002). The use of fetal bovine serum: ethical or scientific problem? ATLA 30, 219-227 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11971757

[6] Shailer C, Corrin, K. (1999). Serum supply: policies and controls operating in New Zealand. Dev. Biol. Stand. 99, 71-77 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10404878

[7] van der Valk J. et al. The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicol In Vitro. 2004 Feb;18(1):1-12 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14630056

[8] van der Valk J. et al. Optimization of chemically defined cell culture media – Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicol In Vitro. 2010 Jun;24(4):1053-63. doi: 10.1016/j.tiv.2010.03.016. Epub 2010 Mar 31 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20362047

[9] 3R, CCAC. Fetal Bovine Serum – http://3rs.ccac.ca/en/testing-and-production/tp-production/fetal-bovine-serum.html

[10] Tekkatte C. et al. ”Humanized” stem cell culture techniques: the animal serum controversy. Stem Cells Int. 2011;2011:504723. doi: 10.4061/2011/504723. Epub 2011 Apr 3 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21603148

[11] Bjare U. (1992). Serum-free cell culture. Pharmacol Ther. 1992;53(3):355-74 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1409851

[12] Gstraunthaler G. (2003). Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX 20, 275-281 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14671707

[13] Price P. J., Gregory E. A. (1982). Relationship between in vitro growth promotion and biophysical and biochemical properties of the serum supplement. In Vitro. 1982; Jun;18(6):576-84 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7118138

[14] Dormont D. (1999). Transmissible spongiform encephalopathy agents and animal sera. Dev. Biol. Stand. 99, 25-34 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10404872

[15] Eloit M. (1999). Risks of virus transmission associated with animal sera or substitutes and methods of control. Dev. Biol. Stand. 99, 9-16 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10404870

[16] Wessman S. J., Levings R. L. (1999). Benefits and risks due to animal serum used in cell culture production. Dev. Biol. Stand. 99, 3-8 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10404869

[17] Stoll L. L., Spector A. A. (1984). Changes in serum influence the fatty acid composition of established cell lines. In Vitro 20, 732-738 – http://www.jstor.org/discover/10.2307/4292874?uid=3738296&uid=2&uid=4&sid=21104473031437

[18] Even M. S. et al. (2006). Serum-free hybridoma culture: ethical, scientific and safety considerations. Trends Biotechnol. 2006 Mar;24(3):105-8. Epub 2006 Jan 19 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16427150

[19] Lindl T, Gstraunthaler G. (2008). Zell- und Gewebekultur Von den Grundlagen zur Laborbank. 6. Aufl. Heidelberg – Berlin: Spektrum Akademischer Verlag

[20] Taub M. (1990). The use of defined media in cell and tissue culture. Toxicol. in Vitro 1990;4(3):213-25 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20837419

[21] Witzeneder K. et al. Human-Derived Alternatives to Fetal Bovine Serum in Cell Culture. Transfus Med Hemother 2013;40:417-423 (DOI:10.1159/000356236) – http://www.karger.com/Article/FullText/356236

[22] Woehrling EK et al. Brain-derived neurotrophic factor as an indicator of chemical neurotoxicity: an animal-free CNS cell culture model. Altern Lab Anim. 2013 Dec;41(6):503-11

[23] Rauch C. et al. Alternatives to the Use of Fetal Bovine Serum: Human Platelet Lysates as a Serum Substitute in Cell Culture Media. ALTEX. 2011;28(4):305-16

[24] ZenBio. Human Serum & Animal-Free Growth Supplement – http://www.zen-bio.com/products/serum/fetal-bovine-serum.php

[25] Gstraunthaler G. et al. A plea to reduce or replace fetal bovine serum in cell culture media. Cytotechnology. 2013 Oct;65(5):791-3. doi: 10.1007/s10616-013-9633-8. Epub 2013 Aug 22 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23975256

[26] Gstraunthaler G. et al. INT: FBS production problems demand to call for serum-free media. ALTEX. 4/13 – http://www.altex.ch/News.17.html?ncat=1&eid=320

Note:

Tavola Alternative sostitutive al siero animale

http://www.dierproeveninformatie.nl/downloads/FCS-free+table+Jan+2009.pdf

Esempio di company che le produce

http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/bioprocess-systems/upstream/serum-free-media-and-feed-formulations.aspx

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